Արագ կայքի ուղղորդված մուտագենեզի հավաքածու

A-1 կաղապար

■ Կաղապարը պարունակում է սպիտակուցային խառնուրդներ կամ Taq ինհիբիտորներ և այլն: —— Մաքրել ԴՆԹ ձևանմուշը, հեռացնել սպիտակուցային կեղտերը կամ հանել մաքրման հավաքածուներով ԴՆԹ ձևանմուշը:

Temp Կաղապարի հետադարձումը լիարժեք չէ. —Համապատասխանաբար բարձրացնել դենատուրացիայի ջերմաստիճանը և երկարացնել Denaturation time- ը:

■ Կաղապարի դեգրադացիա —— Կրկին պատրաստեք կաղապարը:

A-2 այբբենարան

Prim Նախնական այբբենարանների վատ որակը.

■ Այբբենարանի քայքայումը —— բարձր կոնցենտրացիայի հիմքերը փոքր ծավալի բաժանեք պահպանման համար: Խուսափեք բազմակի սառեցումից և հալվելուց կամ երկարաժամկետ 4 ° C ջերմաստիճանի սառեցման պահպանումից:

Prim այբբենարանների ոչ պատշաճ ձևավորում (օր. Այբբենարանի երկարությունը բավարար չէ, հիմքը ձևավորվում է այբբենարանների միջև և այլն)

A-3 մգ²⁺համակենտրոնացում

Մգ²⁺ համակենտրոնացումը չափազանց ցածր է —— increaseիշտ բարձրացնել Mg– ն²⁺ համակենտրոնացում. օպտիմալացնել Mg- ը²⁺ կոնցենտրացիան մի շարք ռեակցիաներով `1 մմ -ից մինչև 3 մմ, 0.5 մմ միջակայքով` օպտիմալ Mg որոշելու համար²⁺ կոնցենտրացիան յուրաքանչյուր կաղապարի և այբբենարանի համար:

A-4 Կռման ջերմաստիճան

An Խտացման բարձր ջերմաստիճանը ազդում է այբբենարանի և կաղապարի կապման վրա: - Կրճատել կռացման ջերմաստիճանը և օպտիմալացնել վիճակը 2 ° C գրադիենտով:

A-5 Երկարացման ժամանակ

Extension Կարճաժամկետ երկարացում —— Բարձրացրեք երկարացման ժամանակը:

Երեւույթներ. Բացասական նմուշները ցույց են տալիս նաեւ թիրախային հաջորդականության գոտիները:

A-1 PCR- ի աղտոտում

Target Թիրախային հաջորդականության կամ ուժեղացման արտադրանքի խաչաձև աղտոտում. Ռեակտիվները կամ սարքավորումները պետք է ավտոկլավավորվեն `գոյություն ունեցող նուկլեինաթթուները վերացնելու համար, իսկ վարակման առկայությունը պետք է որոշվի բացասական հսկողության փորձերի միջոցով:

■ Ռեագենտով վարակվածություն.

A-2 Primer

Մգ²⁺ համակենտրոնացումը չափազանց ցածր է —— increaseիշտ բարձրացնել Mg– ն²⁺ համակենտրոնացում. օպտիմալացնել Mg- ը²⁺ կոնցենտրացիան մի շարք ռեակցիաներով `1 մմ -ից մինչև 3 մմ, 0.5 մմ միջակայքով` օպտիմալ Mg որոշելու համար²⁺ կոնցենտրացիան յուրաքանչյուր կաղապարի և այբբենարանի համար:

Prim Այբբենարանի ոչ պատշաճ ձևավորում, և թիրախային հաջորդականությունն ունի հոմոլոգիա ոչ նպատակային հաջորդականության հետ: —— Նախաստեղծ այբբենարաններ:

Ֆենոմեններ. PCR ուժեղացման գոտիները անհամապատասխան են սպասվող չափին ՝ մեծ կամ փոքր, երբեմն էլ լինում են ինչպես հատուկ ուժեղացման գոտիներ, այնպես էլ ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման գոտիներ:

A-1 այբբենարան

Prim Այբբենարանի վատ յուրահատկություն

—— Նոր դիզայնի այբբենարան:

■ Նախաներկի կոնցենտրացիան չափազանց բարձր է. —Roիշտ բարձրացնել դենատուրացիայի ջերմաստիճանը և երկարացնել դենատուրացիայի ժամանակը:

A-2 մգ²⁺ համակենտրոնացում

The Mg²⁺ կոնցենտրացիան չափազանց բարձր է —— reduceիշտ նվազեցնել Mg2+ կոնցենտրացիան²⁺ կոնցենտրացիան մի շարք ռեակցիաներով `1 մմ -ից մինչև 3 մմ, 0.5 մմ միջակայքով` օպտիմալ Mg որոշելու համար²⁺ կոնցենտրացիան յուրաքանչյուր կաղապարի և այբբենարանի համար:

A-3 rmերմակայուն պոլիմերազա

En Չափից մեծ ֆերմենտի քանակ - —Պակասեցրեք ֆերմենտի քանակը համապատասխանաբար 0.5 U ընդմիջումներով:

A-4 Կռման ջերմաստիճան

An Կռման ջերմաստիճանը չափազանց ցածր է .— increaseիշտ բարձրացնել կռացման ջերմաստիճանը կամ ընդունել երկաստիճան հովացման մեթոդը

A-5 PCR ցիկլեր

PC Չափից շատ PCR ցիկլեր —— Կրճատեք PCR ցիկլերի քանակը:

A-1 այբբենարան—————————––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––————————————————————————————————————————————————————————————————— -րագրի վերափոխում, փոխում այբբենարանի դիրքն ու երկարությունը ՝ դրա յուրահատկությունը բարձրացնելու համար. կամ կատարել ներկառուցված PCR:

A-2 Կաղապար ԴՆԹ

—— Կաղապարը մաքուր չէ —— Մաքրեք կաղապարը կամ հանեք ԴՆԹ – ն մաքրման հավաքածուներով:

A-3 մգ²⁺ համակենտրոնացում

—— Մգ²⁺ համակենտրոնացումը չափազանց բարձր է —— reduceիշտ նվազեցնել Mg– ն²⁺ համակենտրոնացում. օպտիմալացնել Mg- ը²⁺ կոնցենտրացիան մի շարք ռեակցիաներով `1 մմ -ից մինչև 3 մմ, 0.5 մմ միջակայքով` օպտիմալ Mg որոշելու համար²⁺ կոնցենտրացիան յուրաքանչյուր կաղապարի և այբբենարանի համար:

A-4 dNTP

—— dNTP– ների կոնցենտրացիան չափազանց բարձր է —— համապատասխանաբար նվազեցնել dNTP– ի կոնցենտրացիան

A-5 Կռման ջերմաստիճան

—— Շատ ցածր հալման ջերմաստիճան —— increaseիշտ բարձրացնել հալման ջերմաստիճանը

A-6 ցիկլեր

—— Չափից շատ ցիկլեր —— Օպտիմալացրեք ցիկլի համարը

Առաջին քայլը համապատասխան պոլիմերազի ընտրությունն է: Սովորական Taq պոլիմերազան չի կարող սրբագրել 3'-5 'էզոնուկլազի ակտիվության բացակայության պատճառով, և անհամապատասխանությունը մեծապես կնվազեցնի բեկորների երկարացման արդյունավետությունը: Հետևաբար, սովորական Taq պոլիմերազը չի կարող արդյունավետորեն ուժեղացնել 5 կբ -ից ավելի թիրախային բեկորները: Հատուկ փոփոխությամբ կամ բարձր հավատարմությամբ պոլիմերազով Taq պոլիմերազը պետք է ընտրվի երկարացման արդյունավետությունը բարձրացնելու և բեկորների երկարատև ուժեղացման կարիքները բավարարելու համար: Բացի այդ, երկար բեկորների ուժեղացումը պահանջում է նաև այբբենարանի դիզայնի համապատասխան ճշգրտում, դենատուրացիայի ժամանակ, երկարացման ժամանակ, բուֆերային pH և այլն: Կաղապարի վնասը կանխելու համար 94 ° C- ում դենատուրացիայի ժամանակը պետք է կրճատվի մինչև 30 վրկ կամ ավելի մեկ ցիկլով, իսկ ջերմաստիճանը մինչև 94 ° C բարձրացնելուց առաջ ՝ 1 րոպեից պակաս: Ավելին, երկարացման ջերմաստիճանը մոտ 68 ° C- ով սահմանելը և երկարացման ժամանակը նախագծելը `1 կբ/րոպե արագության համաձայն, կարող են ապահովել երկար բեկորների արդյունավետ ուժեղացում:

PCR- ի ուժեղացման սխալի մակարդակը կարող է նվազեցվել ՝ օգտագործելով բարձր հավատարմությամբ տարբեր ԴՆԹ պոլիմերազներ: Մինչ այժմ հայտնաբերված Taq ԴՆԹ -ի պոլիմերազներից Pfu ֆերմենտն ունի ամենացածր սխալի տոկոսադրույքը և ամենաբարձր հավատարմությունը (տես կցված աղյուսակը): Ֆերմենտի ընտրությունից բացի, հետազոտողները կարող են հետագայում նվազեցնել PCR մուտացիայի արագությունը `օպտիմալացնելով ռեակցիայի պայմանները, ներառյալ բուֆերային կազմի օպտիմալացումը, ջերմակայուն պոլիմերազի կոնցենտրացիան և PCR ցիկլի օպտիմալացումը: