FastKing One Step RT-PCR հավաքածու

A-1 RNA- ն դեգրադացված է

—— Մաքրել բարձրորակ ՌՆԹ ՝ առանց աղտոտման: Նյութը, որից վերցված է ՌՆԹ -ն, պետք է հնարավորինս թարմ լինի `կանխելու ՌՆԹ -ի քայքայումը: Վերլուծեք ՌՆԹ ամբողջականությունը դենատուրացված գելի վրա ՝ նախքան RT արձագանքը: ՌՆԹ արդյունահանումից հետո այն պետք է պահվի 100% ֆորմամիդում: Եթե ​​օգտագործվում է RNase inhibitor- ը, ապա ջեռուցման ջերմաստիճանը պետք է լինի <45 ° C, իսկ pH- ը `8.0 -ից պակաս, հակառակ դեպքում ինհիբիտորը կազատի բոլոր կապված RNase- ը: Ավելին, RNase inhibitor- ը պետք է ավելացվի solutions 0.8 մմ DTT պարունակող լուծույթներում:

A-2 RNA- ն պարունակում է հակադարձ արտագրման ռեակցիաների արգելիչներ

- - Հակադարձ տառադարձման ինհիբիտորները ներառում են SDS, EDTA, գլիցերին, նատրիումի պիրոֆոսֆատ, սպերմիդին, ֆորմամիդ, գուանիդինի աղ և այլն: Խառնել վերահսկիչ RNA- ն նմուշի հետ և համեմատել եկամտաբերությունը վերահսկիչ RNA ռեակցիայի հետ `ստուգելու, թե արդյոք կա արգելակիչ: Լվանալ ՌՆԹ -ի տեղումները 70% (v/v) էթանոլով `արգելիչները հեռացնելու համար:

A-3 cDNA- ի առաջին շղթայի սինթեզման համար օգտագործվող այբբենարանների անբավարար հալեցում

—— Որոշեք, որ հալման ջերմաստիճանը հարմար է փորձի ժամանակ օգտագործվող հիմքերի համար: Պատահական վեցանկյունների դեպքում խորհուրդ է տրվում պահպանել ջերմաստիճանը 25 ° C ջերմաստիճանում 10 րոպե առաջ ՝ մինչև ռեակցիայի ջերմաստիճանին հասնելը: Գենին հատուկ այբբենարանների համար (GSP) փորձեք այլ GSP կամ անցեք օլիգոյի (dT) կամ պատահական վեցամերայի:

A-4 Սկսնակ փոքր քանակությամբ ՌՆԹ

—— Բարձրացրեք ՌՆԹ -ի քանակը: 50 նգ -ից պակաս ՌՆԹ նմուշների համար 0,1 մկգ -ից մինչև 0,5 մկգ ացետիլ BSA կարող է օգտագործվել առաջին շղթայի cDNA սինթեզում

A-5 Թիրախային հաջորդականությունը չի արտահայտվում վերլուծված հյուսվածքներում:

--— Փորձեք այլ հյուսվածքներ:

A-6 PCR արձագանքը ձախողվում է

—— Երկաստիճան RT-PCR- ի դեպքում PCR քայլում cDNA ձևանմուշը չի կարող գերազանցել արձագանքի ծավալի 1/5-ը:

A-1 Այբբենարանների և կաղապարների ոչ հատուկ հալեցում

--— Նախաներկի 3'-վերջը չպետք է պարունակի 2-3 դԳ կամ դԿ: Առաջին շղթայի սինթեզում օգտագործեք Գենին հատուկ պրիմերներ `պատահական այբբենարանների կամ օլիգոյի (dT) փոխարեն: Առաջին մի քանի ցիկլերում օգտագործեք հալման ավելի բարձր ջերմաստիճան, այնուհետև ավելի ցածր ջերմաստիճան: Օգտագործեք տաք մեկնարկի Taq ԴՆԹ պոլիմերազը PCR- ի համար `ռեակցիայի յուրահատկությունը բարելավելու համար:

A-2 Գենին հատուկ այբբենարանների վատ ձևավորում

--— Հետևեք նույն սկզբունքներին ուժեղացման այբբենարանի նախագծման համար:

A-3 RNA- ն աղտոտված է գենոմային ԴՆԹ-ով

—— Բուժեք ՌՆԹ-ն PCR դասարանի DNase I. Ստեղծեք վերահսկիչ ռեակցիա ՝ առանց հակադարձ տառադարձման ՝ ԴՆԹ-ի աղտոտվածությունը հայտնաբերելու համար:

A-4 Պրիմերային dimer- ի ձևավորում

—— Նախագծեք այբբենարաններ առանց լրացուցիչ հաջորդականությունների 3 -րդ վերջում:

A-5 Չափից բարձր մգ²⁺ համակենտրոնացում

—— Օպտիմալացրեք Mg- ն²⁺ կոնցենտրացիան յուրաքանչյուր կաղապարի և այբբենարանի համադրության համար

A-6 Աղտոտված օտարերկրյա ԴՆԹ-ով

--— Օգտագործեք աերոզոլային դիմացկուն խորհուրդներ և UDG ֆերմենտներ:

A-1 Առաջին շարանի արտադրանքի պարունակությունը չափազանց բարձր է

--— Կրճատեք առաջին շղթայի արտադրանքի գումարը պայմանական PCR ռեակցիայի փուլում:

A-2 PCR ռեակցիայի պրիմերի չափազանց մեծ քանակ

--— Կրճատել այբբենարանի ներածումը:

A-3 Չափից շատ ցիկլեր

—— Օպտիմալացրեք PCR ռեակցիայի պայմանները և նվազեցրեք PCR ցիկլի թիվը:

A-4 Հալման չափազանց ցածր ջերմաստիճան

—— Բարձրացրեք կռելու ջերմաստիճանը ՝ կանխելու ոչ հատուկ սկիզբն ու երկարացումը:

A-5 ԴՆԹ-ի DNase դեգրադացիայի արդյունքում առաջացած օլիգոնուկլեոտիդների բեկորների ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացում.

RT-PCR- ը պետք է հակադարձ արտագրել ՌՆԹ-ն cDNA- ի, այնուհետև օգտագործել հակադարձ արտագրված cDNA- ն ՝ որպես PCR ռեակցիայի կաղապար `թիրախային հատվածն ուժեղացնելու համար: Ընտրեք կամ պատահական այբբենարաններ, Oligo dT և գենին հատուկ այբբենարաններ `համաձայն փորձի հատուկ պայմանների: Բոլոր վերը նշված այբբենարանները կարող են օգտագործվել կարճ էուկարիոտիկ բջիջների mRNA- ի համար ՝ առանց սանրվածքի կառուցվածքի:

Պատահական այբբենարան. Հարմար է մազակալների կառուցվածքով երկար ՌՆԹ-ի, ինչպես նաև բոլոր տեսակի ՌՆԹ-երի համար, ինչպիսիք են ՝ rRNA, mRNA, tRNA և այլն: Դրանք հիմնականում օգտագործվում են մեկ կաղապարի RT-PCR արձագանքի համար:

Oligo dT. Հարմար է RNA- ի համար PolyA պոչով (պրոկարիոտիկ RNA, էուկարիոտիկ Oligo dT rRNA և tRNA չունեն PolyA պոչեր): Քանի որ Oligo dT- ն կապված է PolyA պոչին, ՌՆԹ-ի նմուշների որակը պահանջվում է բարձր լինել, և նույնիսկ փոքր քանակությամբ դեգրադացիան մեծապես կնվազեցնի լիարժեք cDNA սինթեզի քանակը:

Գենին հատուկ այբբենարան. Կաղապարային հաջորդականության լրացում, որը հարմար է այն իրավիճակների համար, երբ թիրախային հաջորդականությունը հայտնի է:

Երկու եղանակ կա.

1. Ներքին հղման մեթոդ. Տեսականորեն cDNA- ն տարբեր երկարությունների ԴՆԹ -ի բեկորներ են, ուստի էլեկտրոֆորեզի արդյունքը քսելն է: Եթե ​​ՌՆԹ -ի առատությունը ցածր է, ապա ոչ մի ապրանք չի ցուցադրվի էլեկտրոֆորեզում, բայց դա չի նշանակում, որ ոչ մի ապրանք չի ուժեղանա PCR- ով: Ընդհանուր առմամբ, ներքին հղումը կարող է օգտագործվել cDNA հայտնաբերելու համար: Եթե ​​ներքին տեղեկանքն ունի արդյունքներ, ապա cDNA- ի որակը կարող է հիմնականում երաշխավորվել (մի քանի դեպքերում, եթե թիրախային գենի հատվածը չափազանց երկար է, կարող են լինել բացառություններ):

2. Եթե կա հայտնի գեն, որն ուժեղացված է այս կաղապարի միջոցով, այն կարող է հաստատվել այս գենի սկզբնաղբյուրների միջոցով: Ներքին հղումների ուժեղացումն անպայման չի նշանակում, որ cDNA- ի հետ խնդիր չկա: Քանի որ ներքին հղումը cDNA- ում մեծ առատություն ունի, այն հեշտ է ուժեղացնել: Եթե ​​cDNA- ն մասամբ քայքայվի տարբեր պատճառներով, հավանականության տեսանկյունից, ցածր առատության թիրախային գեների PCR արդյունքները մեծապես կազդեն: Մինչ ներքին հղումները դեռ առատ են, ուժեղացումը, հավանաբար, չի ազդի:

ՌՆԹ -ի մասնակի քայքայում: Հայտնաբերեք ամբողջականությունը և մաքրեք ՌՆԹ -ն

Տարբեր տեսակների ՌՆԹ պարունակությունը կարող է տարբեր լինել, բայց ընդհանուր առմամբ, արդյունահանվող ընդհանուր ՌՆԹ -ն պետք է պարունակի երկու հստակ 28S և 18S շերտեր գելային էլեկտրոֆորեզում, իսկ նախկին շերտի պայծառությունը պետք է կրկնակի ավելի բարձր լինի, քան վերջինիս: 5S խումբը ցույց է տալիս, որ ՌՆԹ -ն դեգրադացվել է, և դրա պայծառությունը համաչափ է դեգրադացիայի աստիճանին: Ներքին հղումների հաջող ուժեղացումը չի նշանակում, որ ՌՆԹ -ի հետ խնդիր չկա, քանի որ ներքին հղումը մեծ առատությամբ է, ՌՆԹ -ն կարող է ուժեղացվել այնքան ժամանակ, քանի դեռ դեգրադացիան լուրջ չէ: The OD₂₆₀/ՕԴ₂₈₀Սպեկտրոֆոտոմետրով չափվող մաքուր ՌՆԹ -ի հարաբերակցությունը պետք է լինի 1.9 -ից 2.1 -ի սահմաններում: Փոքր քանակությամբ սպիտակուցի կեղտը ՌՆԹ -ում կնվազեցնի հարաբերակցությունը: Քանի դեռ արժեքը չափազանց ցածր չէ, RT- ն չի ազդի: RT- ի համար ամենակարևորը RNA ամբողջականությունն է:

Ներքին հղման գենի ընդլայնումը կարող է միայն ցույց տալ, որ RT- ն հաջողվել է, բայց դա պարտադիր չէ, որ կապված լինի cDNA շղթայի որակի հետ: Քանի որ ներքին տեղեկատուի բեկորներն ընդհանրապես փոքր են չափսերով և արտահայտչականությամբ, հակադարձ արտագրության մեջ ավելի հեշտ է հաջողակ լինել: Այնուամենայնիվ, թիրախային գենի չափը և արտահայտությունը տարբերվում են գենից գեն: CDNA- ի որակի մասին չի կարելի դատել միայն ներքին հղումով, հատկապես 2 կբ -ից երկար թիրախային բեկորների համար:

Որոշ նմուշներ ունեն բարդ երկրորդային կառուցվածք, կամ ունեն հարուստ GC պարունակություն, կամ թանկարժեք են փոքր առատությամբ: Այս դեպքերում համապատասխան հակադարձ տրանսկրիպտազը պետք է ընտրվի `ըստ թիրախային հատվածի և նմուշի չափի: RC- ի բարձր պարունակությամբ և բարդ երկրորդային կառուցվածքով ՌՆԹ կաղապարների համար դժվար է բացել երկրորդային կառուցվածքը ցածր ջերմաստիճանում կամ սովորական հակադարձ տրանսկրիպտազով: Այս կաղապարների համար կարելի է ընտրել Quant Reverse Transcriptase- ը, քանի որ դրա հակադարձ տրանսկրիպցիոնացիան ակնհայտորեն ավելի լավ է, քան M-MLV շարքի հակադարձ transcriptase- ը, որը կարող է արդյունավետ կերպով հակադարձ արտագրել տարբեր RNA ձևանմուշներ և RNA- ն առավելագույն չափով արտագրել cDNA- ի առաջին շղթայի մեջ: Ընդհանուր հակադարձ տրանսկրիպտազային հավաքածու օգտագործելիս 20 μl համակարգը կարող է արդյունավետ կերպով հակադարձել միայն 1 մկգ ընդհանուր ՌՆԹ -ն: Խնդրում ենք ուշադրություն դարձնել հանդերձանքի առավելագույն RT հզորությանը: Եթե ​​կաղապարը ավելացվի ավելցուկով, հակադարձ տառադարձումը կնպաստի ՌՆԹ -ին մեծ առատությամբ: Հետեւաբար, ավելի լավ է չգերազանցել համակարգի առավելագույն հզորությունը:

A-1 Որոշեք, արդյոք ՌՆԹ-ն դեգրադացված է, և արդյո՞ք դա հաջողված է

Ընդհանուր առմամբ, ներքին տեղեկատուի ուժեղացման ձախողման պատճառը հաճախ առաջանում է ՌՆԹ -ի լուրջ դեգրադացիայի պատճառով: Մեկ այլ հավանական պատճառն էլ հակադարձ տառադարձումն է: Ներքին հղումը չի կարող օգտագործվել որպես ստանդարտ `cDNA- ի մեկ շղթայի որակը գնահատելու համար, բայց այն կարող է օգտագործվել որպես ստանդարտ` դատելու համար, թե արդյոք հաջող է հակադարձ տառադարձումը, եթե չկա ՌՆԹ որակի խնդիր: Հակադարձ արտագրման գործընթացում ամենակարևորը կայուն ջերմաստիճանի և ռեակցիայի մշտական ​​համակարգի պահպանումն է `ռեակցիայի արդյունավետությունը բարձրացնելու համար:

A-2 Որոշեք, արդյոք ներքին հղումային գեների ուժեղացման պրիմերները հուսալի են, և արդյոք PCR- ում օգտագործվող ռեակտիվների հետ կապված որևէ խնդիր կա:

Հարաբերական քանակականացման համար ՌՆԹ -ն պետք է քանակականացվի նախքան հակադարձ արտագրումը, ինչը նույնպես պահանջվում է հակադարձ տրանսկրիպցիոն բազմաթիվ հավաքածուներում, օրինակ ՝ քանակականացնել ՌՆԹ մուտքագրումը որպես 1 մկգ: Քանի որ հակառակ արտագրված cDNA- ն խառը լուծում է, ներառյալ RNA, oligo dT, enzyme, dNTP և նույնիսկ ԴՆԹ -ի մի փոքր մնացորդ, շեղում կառաջանա, ուստի անհնար է ճշգրիտ քանակականացնել cDNA- ն: Հետևաբար, անհրաժեշտ է ՌՆԹ քանակականացում: Հաշվի առնելով, որ հակադարձ արտագրման արդյունավետությունը նույնն է տարբեր նմուշների միջև, ստացված cDNA- ի քանակը պետք է լինի նույնը, և քանակական վերլուծությունը կարող է ցույց տալ տարբեր գեների արտահայտման մակարդակների համեմատությունը ընդհանուր ՌՆԹ -ի նույն քանակությամբ: Հարաբերական ֆլուորեսցենտային քանակական PCR կատարելիս քանակական cDNA չի կարող պահանջվել հակադարձ արտագրումից հետո, քանի որ ներքին հղման գենը կարող է գործել որպես հղում:

Այն հիմնականում կապված է գեների հետ, և երկար հատվածի հակադարձ տառադարձումն անհնար է գեների մեծ մասի համար: Նախ, հակադարձ արտագրման արդյունավետությունը շատ ավելի ցածր է, քան PCR- ը: Երկրորդ, GC հարուստ շրջանը և շատ գեների երկրորդային կառուցվածքը սահմանափակում են ինչպես հակադարձ արտագրումը, այնպես էլ PCR- ն: Ի վերջո, PCR- ի հավատարմությունն ու ուժեղացման արդյունավետությունը դժվար է միաժամանակ երաշխավորել: Հակադարձ տառադարձման գործընթացում ոչ ոք չի կարող երաշխավորել ցածր պատճենահանման գեների երկար հատված ստանալը, հատկապես `օգտագործելով oligo dT: Ինչ վերաբերում է 5 'UTR- ին ավելի GC- ով, ապա դա նույնիսկ ավելի դժվար է: Հետևաբար, դեռևս ողջամիտ մեթոդ է պատահական այբբենարաններով տառադարձումը հակադարձելը, նպատակային հատվածի բնական ճեղքման տեղերը գտնելը, հատվածներով ուժեղանալը, այնուհետև սահմանափակման մարսումն ու կապումը կատարելը: Ընդհանուր առմամբ, դժվար է ուղղակիորեն ուժեղացնել 2 կբ -ից ավելի բեկորները, բայց դա միշտ չէ, որ անհնար է ձեռք բերել. 2. M-MLV RT-PCR հավաքածուն կարող է ուղղակիորեն օգտագործվել: Երկարացրեք հալման ժամանակը և ճիշտ ավելացրեք ցիկլի թիվը ուժեղացման գործընթացում: Այլապես, ներկառուցված ՊՇՌ -ն կարող է կիրառվել կամ իրականացնել մեկ կամ երկու ռեակցիաներ `նախքան նորմալ ՊՇՌ -ի ուժեղացումից համապատասխան երկարաձգված դենատուրացիայի և երկարացման ժամանակը, ինչը կարող է օգնել բեկորների երկարացմանը: Ուշադրություն դարձրեք պոլիմերազի հավատարմությանը: 3. Long Taq- ը կարող է օգտագործվել PCR- ում `իդեալական արդյունքներ ստանալու համար: 4. Սպիտակուցների արտահայտման կիրառման համար պետք է կիրառվի բարձր հավատարմության պոլիմերազա:

Գոյություն ունեն TIANGEN- ի կողմից առաջարկվող հակադարձ տառադարձման երկու տեսակ ՝ Quant/King RTase և TIANScript M-MLV: Նրանց միջև հիմնական տարբերությունը կաղապարների մուտքագրման քանակն է: Quant- ը յուրահատուկ հակադարձ տրանսկրիպտազ է, որը տարբերվում է Moloney- ի մկների լեյկեմիայի վիրուսից ստացված սովորաբար օգտագործվող M-MLV- ից: Quant- ը նոր բարձր արդյունավետության հակադարձ տրանսկրիպտազ է, որը ռեկոմբինացված կերպով արտահայտվում է ինժեներական Escherichia coli- ով: Quant- ը հարմար է 50 նգ -2 մկգ ՌՆԹ-ի ուժեղացման համար `հակադարձ արտագրման բարձր ակտիվությամբ և բարձր եկամտաբերությամբ: Սովորական MMLV- ի կամ AMV- ի համեմատ, Quant- ի ամենամեծ բնութագիրը կայանում է նրանում, որ այն շատ ուժեղ հարազատություն ունի RNA ձևանմուշների հետ և կարող է հակադարձել տեքստերի բարդ ձևանմուշները `առանց բարձր ջերմաստիճանի դենատուրացիայի: GC- ի ավելի բարձր պարունակությամբ կաղապարների համար հակադարձ արդյունավետությունն ավելի բարձր է: Այնուամենայնիվ, այս հակադարձ տրանսկրիպտազն ունի RNase H ակտիվություն, որը կարող է ազդել cDNA արտադրանքի երկարության վրա (հարմար է <4,5 կբ կաղապարների համար): Պայմանական հակադարձ տառադարձման դեպքում խորհուրդ է տրվում TIANScript MMLV հակադարձ տրանսկրիպտազա: Այս RTase- ը փոփոխված ֆերմենտ է `շատ թույլ RNase H ակտիվությամբ, որը հարմար է երկար (> 5 կբ) cDNA սինթեզի համար:

Միակողմանի հակադարձ արտագրումը և PCR ուժեղացումն ավարտվում են նույն խողովակում ՝ առանց cDNA սինթեզի և ուժեղացման միջև խողովակի ծածկը բացելու, ինչը օգտակար է աղտոտումը նվազեցնելու համար: Քանի որ ստացված cDNA- ի բոլոր նմուշները օգտագործվում են ուժեղացման համար, զգայունությունն ավելի բարձր է `նվազագույնը 0.01 pg ընդհանուր ՌՆԹ -ով: Մեկ քայլով հաջողված RTPCR- ի համար գենային հատուկ պրիմերները հիմնականում օգտագործվում են cDNA սինթեզ սկսելու համար: Երկաստիճան մեթոդը, այսինքն `հակադարձ արտագրումը և PCR ուժեղացումն իրականացվում են երկու քայլով: Նախ հակադարձ տառադարձումը կատարվում է ՌՆԹ կաղապարից `cDNA ստանալու համար, և ստացված cDNA- ն ենթարկվում է մեկ կամ մի քանի տարբեր PCR ռեակցիաների: Երկաստիճան մեթոդը կարող է օգտագործել օլիգո (dT) կամ պատահական այբբենարաններ ՝ cDNA- ի առաջին շղթայի սինթեզը ղեկավարելու համար և կարող է հակադարձ արտագրել բոլոր mRNA տեղեկատվությունը որոշակի նմուշից: