TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina)

Ներկայումս բարձր թողունակության հաջորդականացման տեխնոլոգիան հիմնականում հիմնված է հաջորդ սերնդի հաջորդականացման տեխնոլոգիայի վրա: Քանի որ հաջորդ սերնդի հաջորդականությունների տեխնոլոգիայի ընթերցման տևողությունը սահմանափակ է, մենք պետք է ամբողջ երկարությամբ հաջորդականությունը բաժանենք փոքր բեկորային գրադարանների `հաջորդականացնելու համար: Ըստ հաջորդականության հաջորդական փորձերի կարիքների, մենք սովորաբար ընտրում ենք մեկ ավարտված հաջորդականություն կամ երկակի ավարտական ​​հաջորդականություն: Ներկայումս հաջորդ սերնդի հաջորդող գրադարանի ԴՆԹ-ի բեկորները ընդհանուր առմամբ բաշխված են 200-800 բ / վ սահմաններում:

ա) ԴՆԹ -ն վատ որակի է և պարունակում է ինհիբիտորներ: Օգտագործեք բարձրորակ ԴՆԹ-ի նմուշներ `ֆերմենտների գործունեության արգելակումից խուսափելու համար:

բ) ԴՆԹ-ի նմուշի քանակը անբավարար է, երբ ԴՆԹ գրադարան կառուցելու համար կիրառվում է PCR- առանց մեթոդ: Երբ մասնատված ԴՆԹ-ի մուտքը գերազանցում է 50 նգ-ը, գրադարանի կառուցման գործընթացում ընտրովի կարող է իրականացվել PCR- առանց աշխատանքային հոսքը: Եթե ​​գրադարանի պատճենահանման համարը չափազանց ցածր է `ուղղակիորեն հաջորդականացնելու համար, ապա ադապտերների կապումից հետո ԴՆԹ գրադարանը կարող է ուժեղացվել PCR- ով:

գ) ՌՆԹ -ի աղտոտումը հանգեցնում է ԴՆԹ -ի նախնական քանակականացման ոչ ճշգրիտ ՌՆԹ -ի աղտոտում կարող է գոյություն ունենալ գենոմային ԴՆԹ -ի մաքրման գործընթացում, ինչը կարող է հանգեցնել ԴՆԹ -ի ոչ ճշգրիտ քանակականացման և գրադարանի կառուցման ընթացքում ԴՆԹ -ի անբավարար բեռնման: ՌՆԹ -ն կարող է հեռացվել ՝ բուժվելով RNase- ով:

Ա -1

ա) Փոքր բեկորներ (60 bp-120 bp) հայտնվում են Փոքր բեկորները սովորաբար ադապտերային բեկորներ են կամ ադապտերների կողմից ձևավորված դիմերներ: Agencourt AMPure XP մագնիսական ուլունքներով մաքրումը կարող է արդյունավետ կերպով հեռացնել այդ ադապտերների բեկորները և ապահովել հաջորդականության որակը:

բ) Գրադարանում PCR- ի ուժեղացումից հետո մեծ բեկորներ են հայտնվում: Գրադարանային ԴՆԹ -ի բեկորների չափը ադապտորը կապելուց հետո կավելանա 120 բ.պ -ով: Եթե ​​ադապտերների կապումից հետո ԴՆԹ -ի բեկորն ավելանում է ավելի քան 120 բ.պ. -ով, ապա դա կարող է առաջանալ PCR- ի չափից ավելի ուժեղացման աննորմալ բեկորի ուժեղացումից: ՊՇՌ ցիկլերի քանակի կրճատումը կարող է կանխել իրավիճակը:

գ) Գրադարանային ԴՆԹ -ի բեկորների աննորմալ չափը ադապտերների կապումից հետո Այս հանդերձում ադապտերի երկարությունը 60 bp է: Երբ բեկորի երկու ծայրերը կապվում են ադապտերներին, երկարությունը կավելանա միայն 120 բ.պ. Երբ օգտագործում եք ադապտեր, որը նախատեսված չէ այս հավաքածուի մեջ, խնդրում ենք կապ հաստատել մատակարարի հետ `համապատասխան տեղեկություններ տրամադրելու համար, ինչպիսիք են ադապտերի երկարությունը: Խնդրում ենք համոզվել, որ փորձի աշխատանքի ընթացքն ու աշխատանքը հետևում են ձեռնարկում նկարագրված քայլերին:

դ) ԴՆԹ -ի աննորմալ բեկորների չափը `ադապտերների կապումից առաջ: Այս խնդրի պատճառը կարող է առաջանալ ԴՆԹ -ի մասնատման ընթացքում ռեակցիայի սխալ պայմաններից: ԴՆԹ -ի տարբեր մուտքերի համար պետք է օգտագործվեն տարբեր ռեակցիաների ժամանակներ: Եթե ​​ԴՆԹ-ի մուտքն ավելի քան 10 նգ է, խորհուրդ ենք տալիս ընտրել օպտիմալացման մեկնարկի համար 12 րոպեի արձագանքի ժամանակը, և այս պահին արտադրված բեկորի չափը հիմնականում կազմում է 300-500 բ / վ սահմաններում: Օգտագործողները կարող են 2-4 րոպեով մեծացնել կամ նվազեցնել ԴՆԹ-ի բեկորների երկարությունը `ըստ իրենց սեփական պահանջների` պահանջվող չափի ԴՆԹ-ի բեկորները օպտիմալացնելու համար:

Ա -2

ա) Կոտրման ժամանակը օպտիմիզացված չէ արձագանքման համակարգը `3 րոպե երկարացնելու կամ կրճատելու համար` մասնատման ժամանակի ավելի ճշգրիտ ճշգրտում կատարելու համար:

Ա -3

Պառակտման բուժումից հետո ԴՆԹ -ի չափսերի աննորմալ բաշխում

ա) մասնատման ռեագենտի հալման ոչ ճիշտ մեթոդը, կամ ռեակտիվը հալվելուց հետո ամբողջությամբ չի խառնվում: Սառույցի վրա հալեցնել 5 × մասնատման ֆերմենտային խառնուրդի ռեակտիվը: Հալվելուց հետո ռեագենտը հավասարաչափ խառնել ՝ նրբորեն թրթռալով խողովակի ներքևի մասում: Մի պտտեք ռեակտիվը:

բ) ԴՆԹ -ի ներմուծման նմուշը պարունակում է EDTA կամ այլ աղտոտիչներ Աղի իոնների և քելատացնող նյութերի քայքայումը ԴՆԹ -ի մաքրման փուլում հատկապես կարևոր է փորձի հաջողության համար: Եթե ​​ԴՆԹ -ն լուծարվում է 1 × TE- ում, մասնատում կատարելու համար օգտագործեք հրահանգում նշված մեթոդը: Եթե ​​լուծույթի մեջ EDTA- ի կոնցենտրացիան անորոշ է, ապա հետագա ռեակցիայի համար խորհուրդ է տրվում մաքրել ԴՆԹ -ն և լուծարել այն դեոնացված ջրում:

գ) ԴՆԹ -ի սկզբնական ոչ ճշգրիտ քանակականացում Բեկորացված ԴՆԹ -ի չափը սերտորեն կապված է ԴՆԹ -ի մուտքի քանակի հետ: Մինչև մասնատված բուժումը, Qubit, Picogreen և այլ մեթոդների միջոցով ԴՆԹ -ի ճշգրիտ քանակականացումը էական նշանակություն ունի ռեակցիայի համակարգում ԴՆԹ -ի ճշգրիտ քանակությունը որոշելու համար:

 դ) Ռեակցիայի համակարգի պատրաստումը չի հետևում հրահանգին: Կոտրված ռեակցիայի համակարգի պատրաստումը պետք է իրականացվի սառույցի վրա `խստորեն հրահանգների համաձայն: Լավագույն ազդեցություն ապահովելու համար ռեակցիայի բոլոր բաղադրիչները պետք է տեղադրվեն սառույցի վրա, իսկ ռեակցիայի համակարգի պատրաստումը պետք է իրականացվի ամբողջական հովացումից հետո: Նախապատրաստումն ավարտվելուց հետո խնդրում ենք թարթել կամ սղոցել, որպեսզի մանրակրկիտ խառնվի: Մի պտտվեք:

1. Խառնման ոչ ճիշտ մեթոդը (հորձանուտ, բռնի տատանում և այլն) կառաջացնի գրադարանային բեկորների աննորմալ բաշխում (ինչպես ցույց է տրված ստորև ներկայացված նկարում) ՝ դրանով իսկ ազդելով գրադարանի որակի վրա: Հետևաբար, Fragmentation Mix- ի ռեակցիայի լուծույթը պատրաստելիս խնդրում ենք նրբորեն խողովակաշարով վեր և վար ներքև խառնել, կամ մատի ծայրով շարժվել և հավասարաչափ խառնել: Carefulգույշ եղեք, որ չխառնվեք պտույտի հետ:

2. Գրադարանի կառուցման համար պետք է օգտագործվի բարձր մաքրության ԴՆԹ

DNA ԴՆԹ -ի լավ ամբողջականություն. Էլեկտրոֆորեզի գոտին ավելի քան 30 կբ է ՝ առանց պոչի

■ OD260/230:> 1.5

OD260/280 ՝ 1.7-1.9

3. ԴՆԹ -ի մուտքագրման գումարը պետք է ճշգրիտ լինի: ԴՆԹ -ի քանակականացման համար առաջարկվում է օգտագործել Qubit և PicoGreen մեթոդներ, այլ ոչ թե Nanodrop:

4. ԴՆԹ -ի լուծույթում EDTA- ի պարունակությունը պետք է որոշվի: EDTA- ն մեծ ազդեցություն ունի բեկորային ռեակցիայի վրա: Եթե ​​EDTA- ի պարունակությունը բարձր է, ապա անհրաժեշտ է ԴՆԹ -ի մաքրում կատարել մինչև հաջորդ փորձարկումը:

5. Պառակտման ռեակցիայի լուծույթը պետք է պատրաստվի սառույցի վրա: Պառակտման գործընթացը զգայուն է ռեակցիայի ջերմաստիճանի և ժամանակի նկատմամբ (հատկապես ուժեղացուցիչ ավելացնելուց հետո): Ռեակցիայի ժամանակի ճշգրտությունն ապահովելու համար խնդրում ենք պատրաստել սառույցի վրա արձագանքման համակարգ:

6. Պառակտման ռեակցիայի ժամանակը պետք է ճշգրիտ լինի Պառակտման քայլի արձագանքման ժամանակը անմիջականորեն կազդի բեկորային արտադրանքի չափի վրա ՝ դրանով իսկ ազդելով գրադարանում ԴՆԹ բեկորների չափի բաշխման վրա:

1. Ի՞նչ տիպի նմուշ է կիրառելի այս հավաքածուի համար:

Այս հավաքածուի կիրառելի նմուշի տեսակը կարող է լինել ընդհանուր RNA կամ մաքրված mRNA ՝ լավ RNA ամբողջականությամբ: Եթե ​​գրադարանի կառուցման համար օգտագործվում է ընդհանուր ՌՆԹ, խորհուրդ է տրվում օգտագործել rRNA- ի սպառման հավաքածուն (կատ.#4992363/4992364/4992391) `սկզբում rRNA- ն հեռացնելու համար:

2. Կարո՞ղ են FFPE- ի նմուշներն օգտագործվել այս հավաքածուով գրադարան կառուցելու համար:

FFPE նմուշների mRNA- ն որոշ չափով կքայքայվի `համեմատաբար թույլ ամբողջականությամբ: Գրադարանի կառուցման համար այս հավաքածուն օգտագործելիս խորհուրդ է տրվում օպտիմալացնել մասնատման ժամանակը (կրճատել մասնատման ժամանակը կամ մասնատումը չկատարելը):

3. Օգտագործելով արտադրանքի ձեռնարկում նշված չափի ընտրության քայլը, ի՞նչը կարող է պատճառ դառնալ, որ տեղադրված հատվածը փոքր շեղում ունենա:

Չափի ընտրությունը պետք է իրականացվի այս արտադրանքի ձեռնարկում չափի ընտրության քայլին համապատասխան: Եթե ​​կա շեղում, ապա պատճառը կարող է լինել այն, որ մագնիսական ուլունքները հավասարակշռված չեն սենյակային ջերմաստիճանում կամ ամբողջովին խառնված չեն, խողովակը ճշգրիտ չէ կամ հեղուկը մնում է ծայրում: Փորձի համար խորհուրդ է տրվում օգտագործել ցածր ներծծող խորհուրդներ:

4. Գրադարանաշինության մեջ ադապտերների ընտրություն

Գրադարանի կառուցման հավաքածուն չի պարունակում ադապտերային ռեակտիվ, և խորհուրդ է տրվում օգտագործել այս հավաքածուն TIANSeq Single-Index Adapter- ի (Illumina) հետ միասին (4992641/4992642/4992378):

5. Գրադարանի QC

Գրադարանի քանակական հայտնաբերում. Qubit- ը և qPCR- ն օգտագործվում են համապատասխանաբար գրադարանի զանգվածային և մոլային կոնցենտրացիաները որոշելու համար: Գործողությունը խստորեն համապատասխանում է արտադրանքի ձեռնարկին: Գրադարանի կենտրոնացումը, ընդհանուր առմամբ, կհամապատասխանի NGS հաջորդականության պահանջներին: Գրադարանների բաշխման տիրույթի հայտնաբերում. Agilent 2100 Bioanalyzer- ի օգտագործմամբ `գրադարանների բաշխման տիրույթը հայտնաբերելու համար:

6. Ամրապնդման ցիկլի համարի ընտրություն

Հրահանգների համաձայն, PCR ցիկլերի քանակը 6-12 է, և անհրաժեշտ PCR ցիկլերի քանակը պետք է ընտրվի ըստ նմուշի մուտքի: Բարձր եկամտաբեր գրադարաններում սովորաբար ուժեղացում տեղի է ունենում տարբեր աստիճաններով, ինչը դրսևորվում է Agilent 2100 Bioanalyzer- ի հայտնաբերման թիրախային տիրույթի գագաթնակետից մի փոքր ավելի մեծ գագաթնակետով, կամ Qubit- ի հայտնաբերված կոնցենտրացիան ավելի ցածր է, քան qPCR- ը: Մեղմ ուժեղացումն նորմալ երևույթ է, որը չի ազդում գրադարանի հաջորդականության և տվյալների հետագա վերլուծության վրա:

7. Spikes- ը հայտնվում է Agilent 2100 Bioanalyzer- ի հայտնաբերման պրոֆիլում

Agilent 2100 Bioanalyzer- ի հայտնաբերման մեջ բծերի տեսքը պայմանավորված է նմուշների անհավասար մասնատվածությամբ, որտեղ որոշակի չափի ավելի շատ բեկորներ կլինեն, և դա ավելի ակնհայտ կդառնա PCR հարստացումից հետո: Այս դեպքում առաջարկվում է չկատարել չափի ընտրություն, այսինքն `մասնատման պայմանը դնել 94 ° C- ի վրա 15 րոպե ինկուբացիայի համար, որտեղ բեկորի բաշխումը փոքր է և կենտրոնացված, և միատարրությունը կարող է բարելավվել: